高效液相色谱(HPLC)
什么是HPLC？
高效液相色谱法（HPLC）可用于分离化合物的成分，告诉您混合物中每种化合物的含量，并帮助确定每种化合物是什么。
HPLC 是分析各种有机化合物的首选技术。挥发性化合物（VOC 和 SVOC）通常最好用气相色谱仪（GC） 或气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行分析，但高效液相色谱法（HPLC）适用于更多种类的混合物，包括非挥发性或热不稳定分子。它的优点包括多功能性、灵敏度和适用于非常复杂的混合物。
HPLC是如何工作的?
使用高效液相色谱法进行分离是基于分析物中不同化合物与流动相（洗脱液）和固定相的亲和力。样品中某种成分的分子与填料之间的特殊分子间相互作用实际上会导致这些分子被固定相吸收。
与流动相相比，与固定相的相互作用越大，与固定相相互作用的时间就越长，在色谱柱上停留的时间也就越长，该成分的保留时间（Rf）也就越长。该技术的强大之处在于可使用多种流动相和固定相来微调分离效果。
HPLC有哪些不同用途?
高效液相色谱是一种常用且功能强大的色谱技术，可应用于制药、生物分析、食品和饮料、临床、法医、环境和药物开发实验室等领域。
例如，在医疗环境中，高效液相色谱可用于确定生物材料中的物质含量和浓度。这可能包括尿液中的药物分析或血清中维生素含量的检测。
HPLC有哪些不同类型?
正相高效液相色谱法
在正相色谱中，固定相为非极性，流动相为极性。这意味着样品中的任何非极性物质都能更快地洗脱出来，因为它们与流动相更接近，移动速度更快。
反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法与正相色谱法相反。也就是说，极性流动相（如水和极性有机溶剂）与非极性疏水固定相配合使用。
与正相高效液相色谱法相比，反相高效液相色谱法通常更受青睐，因为使用水作为溶剂可消除分析物的保留时间因大气吸水而发生偏差的危险。反相高效液相色谱法也被认为更加灵活，因为疏水固定相可以与疏水、亲水、离子和可电离化合物结合使用，分离出不同的化合物。
等度洗脱与梯度洗脱
等度洗脱是指在流动相中保持恒定的梯度，而梯度洗脱是指在实验中流动相的浓度发生变化。
与等度洗脱相比，梯度洗脱有多个优点，因为它能使整个色谱图中宽度相似的色谱峰间距更加均匀。在等度洗脱过程中，色谱峰的分辨率通常会降低，在洗脱过程的开始阶段，色谱峰之间的距离会非常近，而在洗脱过程的最后阶段，色谱峰之间的距离会变得更宽。梯度洗脱还能缩短运行时间。
不过，等度洗脱通常比梯度洗脱更受青睐，因为梯度洗脱过程需要操作人员更加细心和规范。等度洗脱所需的专业色谱设备也较少。
纯水对高效液相色谱有何影响?
高效液相色谱非常依赖于水的纯度。使用不纯的水源制备洗脱液、空白样、样品和标准品可能会在实验中引入污染，影响分辨率、整合度和基线，从而降低色谱性能。由于水是 HPLC 中用量最大的试剂，因此所选水的纯度必须符合应用灵敏度的要求。
你应该使用哪种类型的水?
对于应用灵敏度一般的 HPLC 实验，我们建议使用 II+ 型水。如果应用的灵敏度较高，则应使用 I+ 超纯水，因为它的电阻率大于 18 MΩ.cm，TOC 值小于 2ppb，细菌小于 1 CFU/mL，内毒素小于 0.03。
仪器仪表
泵:
如果 HPLC 是梯度系统，则可采用低压梯度 (LPG) 或高压梯度 (HPG) 流程。在 HPG 中，溶剂在排出侧混合，并从单个泵输入。而在 LPG 中，溶剂在吸入侧混合。
色谱柱:
色谱柱是所有 HPLC 系统的核心，因为它负责分离样品化合物。根据实验需要，有多种不同的 HPLC 柱可供选择。例如，色谱柱可填充各种不同的填料，以支持各种类型的 HPLC，如反相或正相。
检测器:
检测器测量从色谱柱洗脱的每种物质的时间和数量。检测器记录整个过程中的成分差异，并将其转化为电信号，从而绘制色谱图。
色谱参数：
在整个色谱过程中，检测器产生的电子信号可通过配套的计算机转化为色谱图。这些图表可用于确定样品中存在的物质及其数量。每个信号峰都代表了流动相通过色谱柱的分析物。
从这些峰值中可以获得各种定性信息，从峰值出现的时间到物质的浓度（以图表下的面积表示）。
同样重要的是要考虑过程的分辨率。两个峰之间的分辨率值达到或超过 1.5 意味着样品成分的分离程度达到了可以准确测量峰的高度和宽度的程度。分辨率可通过基本分辨率方程计算得出。
该方程中考虑的 HPLC 参数包括效率因子 (N)、保留因子 (kappa prime) 和分离因子 (α)。然后可以进行调整，如改变实验中使用的溶剂或改变温度，以改变这些参数并提高实验的分辨率。
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